技术分享|《DNA合成、组装与纠错技术研究进展》之DNA组装与纠错技术篇

长片段DNA组装技术目前DNA片段从头合成的长度有限，更长的基因或基因组则需要通过寡核苷酸片段的酶促组装或体内组装获得。通常使用的寡核苷酸组装方法有两种：连接酶组装法（ligasechainreaction，LCR）和聚合酶组装法（polymerasecyclingassembly，PCA）。连接酶组装法通过DNA连接酶将首尾相连、重叠杂交的5'磷酸化寡核苷酸片段连接成双链DNA。聚合酶组装法则利用DNA聚合酶延伸杂交的重叠寡核苷酸片段获得不同长度的混合物，最后用引物扩增出成功组装的全长片段（图1）。PCA具有良好的兼容性，也被应用于芯片合成的寡核苷酸组装。

为了提高基因合成通量并降低成本，整合了合成和组装的微型化和自动化基因合成技术也取得了新进展。2011年，Tian等开发了一种采用多功能芯片和组合酶技术的基因合成方法，将整个基因合成过程从寡核苷酸库合成、库扩增、纠错到基因组装等所有步骤整合到同一块芯片上，中途无需更换反应体系，极大地简化了基因合成流程。TwistBioscience公司以Agilent的寡核苷酸原位合成技术为基础，开发了一套对接式硅片反应器用于自动化基因合成。整合了合成和组装的酶促基因合成技术也取得了新进展。据报道，gSynth酶法DNA合成技术通过合成与组装的循环实现了2.7kb的pUC19质粒的从头合成。

对于寡核苷酸组装后双链DNA的进一步拼接，早期的方法依靠限制性内切酶产生的黏性末端来串联DNA片段。由此发展出来的有BioBrick与BglBrick系统以及采用ⅡS型限制性内切酶切割产生黏性末端实现组装的GoldenGate技术（图1）。但序列依赖性和DNA残痕的引入以及烦琐的操作过程限制了这类方法的应用。利用核酸外切酶、DNA聚合酶与连接酶的单独或协同作用开发的组装方法则摆脱了对限制性内切酶的依赖。这类方法通过产生同源单链互补末端进行组装，包括SLIC、SLiCE、LCR、CPEC和Gibson组装（图1）等多种高效简单的组装方法。其中Gibson组装通过体外一步拼接可以无缝组装长达几十万碱基对的基因组水平的片段。

随着片段长度的增加，DNA在体外很容易受常规操作影响而变得不稳定，超过20kb片段的拼接更多借助生物体内的重组系统进行（图1）。

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母是体内DNA长片段组装的主要宿主细胞，经重组系统与细菌人工染色体（BAC）、枯草芽孢杆菌基因组（BGM）或酵母人工染色体（YAC）重组后，这些宿主细胞可稳定携带大片段DNA，其中BGM具有超过3Mb的克隆能力。相较于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，酿酒酵母拥有更高的同源重组率，对长片段的兼容性好，是同时装配多个DNA片段的首选底盘，基于该系统开发的应用方法也更多。Gibson等在酿酒酵母中一步装配25个DNA片段，形成一个长592kb的环状支原体基因组。中国科学院的研究人员甚至将接近12Mb的酿酒酵母完整基因组拼接成单一的染色体。

现有DNA合成技术的局限，使DNA组装成为基因合成不可或缺的过程。组装过程受连接效率和拼接次数影响显著。使用短初始片段组装染色体或基因组长度DNA所需的分层组装次数较多，过程中所需的克隆挑选和测序等质控成本也会相应增多。此外，组装技术仍面临着一系列问题，需要进一步克服聚合序列、长重复序列和非规范的DNA结构对组装的抑制作用，开发能稳定得到全长无差错遗传系统的载体等。组装工艺优化或新组装技术的开发有待于对上述组装影响因素的微观认识和有效控制。通过计算机算法对影响组装的问题序列进行拆分和序列转换，发展智能组装技术，将有助于解决复杂长片段DNA的组装难题。具有低成本、自动化和一体化特性的微流控组装体系将成为寡核苷酸体外合成和组装整合平台开发的方向；而拥有高效重组系统新宿主的筛选与应用将为DNA体内组装提供更多的选项。

寡核苷酸合成与酶促组装过程都不可避免地产生多种类型的错误。常见的错误包括核苷酸的插入、缺失和取代。纠错技术的使用可有效地去除不同类型的错误从而提高合成产物的正确率。

经化学合成的寡核苷酸链含有大量错误，对这样的寡核苷酸池的纠错过程主要根据合成错误造成的分子量或基团的差异进行分离纯化。如对柱式合成可通过高效液相色谱法（HPLC）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或疏水性纯化柱过滤去除合成不完全的片段。这些方法通量低，对错误区分精确度有限，分离过程损失较大。芯片合成寡核苷酸的纠错可通过直接与序列正确的寡核苷酸捕获探针进行杂交选择，或是Tm均一化（热力学参数）严格杂交筛选手段，过滤寡核苷酸池中的错误片段。Evonetix的DNA合成平台则通过对温度的控制将合成、组装、纠错进行整合，其纠错过程由精确的温度控制去除非完全匹配的DNA链。还可以使用NGS技术纠错，结合DNA芯片合成与高通量测序平台，将合成、组装、测序纠错一体化。

经互补配对后的双链DNA片段的核苷酸插入、缺失、取代错误主要表现为错配和凸起等，这些错误的去除更多是借助基于生物体内的DNA修复体系开发出的DNA酶促纠错技术。通过对互补序列退火，暴露出错配信号，再利用具有错配结合或错配切割活性的酶对DNA双链纠错（图2），从而富集正确序列。

参与DNA修复的错配结合酶MutS及其同源蛋白可以识别并结合各种含错配碱基与单链环的DNA，然后可通过凝胶电泳、毛细管电泳、亲和磁珠或吸附树脂等方法使MutS结合含错配的异源双链与未被结合的同质双链分离。这样两轮重复后，可将错误率降低到1/10kb，与传统的基因合成技术相比错误降低超过15倍。针对错配结合酶MutS的工程改造，在提其高稳定性的同时也有助于市场化应用。对于错误率高的寡核苷酸池，Binkowski等利用MutS进一步开发了同序改组法，通过引入限制性内切酶对DNA双链进行片段化，使得MutS不需要去除整条错误的双链DNA，从而保留大量含有正确序列的短片段，最后通过OE-PCR组装回收全长序列。测试发现3.5kb的片段经过两轮同序改组后错误率降低至1/3.5kb，正确率提高了3.5~4.3倍。MutS纠错方法本质是对含错DNA双链的物理分离。为保证MutS处理后样品中有足够的正确片段，寡核苷酸池中需要有相当一部分序列正确的片段。

运用错配切割酶能达到在原处理池中纠正错误的目的。错配切割酶是识别DNA双链错配位点并在错配位点附近切割的一组错配特异性核酸内切酶。主要包括识别单碱基错配的核酸内切酶和单链特异性核酸酶，这些酶与聚合酶共同作用，利用具有核酸外切酶活性的聚合酶水解切割错误区域，然后通过OE-PCR组装回收全长序列。这种方法可以消除单碱基水平的错误，同时保留大部分序列正确的区域，并且可以进行多次“纠错-组装”循环，直到获得所需纯度的产品。T4核酸内切酶Ⅶ，T7核酸内切酶Ⅰ和E.coli核酸内切酶Ⅴ等可识别并切割双链DNA中单碱基错配、单核苷酸凸起等类型的错误，能有效减少合成基因产物中错配、缺失和插入等错误。单链特异性核酸酶中CEL可在中性pH值下特异性切割不同类型的碱基错配和DNA畸变。在芯片的基因合成纠错中结合使用CEL核酸酶可以将合成基因产物的错误率从1/526bp减少到1/3883bp。两次酶解错误切割反应可进一步将错误率降低至1/8700bp，错误减少了16倍以上。

现有DNA纠错方法大部分还停留在对含错片段的去除，开发基于错配切除并对错误进行修复的纠错方法有望颠覆传统的纠错技术。错配修复需要正确的模板链，体内的错配修复系统通过甲基化修饰区分模板链与新合成子链，并根据模板链来修复新合成链上的错误。借鉴类似的原理在体外区分正确片段与待修复片段，在此基础上识别错误并对错误区域进行单链切割，进而以正确片段为模板修复错误。以此开发的纠错技术将摆脱传统纠错技术的局限，实现真正的体外DNA纠错。