技术分享|《DNA合成、组装与纠错技术研究进展》之DNA合成技术篇

寡核苷酸的化学合成始于20世纪50年代，于80年代开发出亚磷酰胺三酯化学合成法，并应用于柱式合成，在90年代又应用到基于芯片的高通量合成技术中。亚磷酰胺三酯合成法由脱保护（deprotection）、偶联（coupling）、加帽（capping）和氧化（oxidation）四步化学反应组成循环，通过分步活化结合在核苷酸3'位和5'位的化学活性保护基团实现可控合成，在固相载体上从3'到5'方向逐个延伸合成寡核苷酸链。

1—脱保护，用三氯乙酸脱去固相载体上核苷酸5'位的DMT（dimethoxytrityl）保护基团，获得供下一步缩合反应的游离5'羟基；

2—偶联，将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合，形成亚磷酰胺四唑活性中间体（其3'端已被活化，但5'端仍受DMT保护），与脱保护后生成的5'羟基发生缩合反应，寡核苷酸链向前延长一个核苷酸；

3—加帽，缩合反应后，通过乙酰化来封闭未参与反应的5'羟基，防止其在随后的循环反应中被延伸，以减少产物中单核苷酸缺失片段的比例；

4—氧化，用碘的四氢呋喃溶液将连接3'，5'的不稳定亚磷酰胺三酯氧化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸链］

基于亚磷酰胺三酯合成法的柱式DNA合成技术，以填充多孔玻璃（controlledporeglass，CPG）或聚苯乙烯（polystyrene，PS）筛板的合成柱作为固相载体，带保护的单体经过化学试剂分步活化被逐个按序添加到固定在合成柱的引发剂上。目前商品化的柱式DNA合成反应偶联效率可达98%~99.8%，错误率约为1/600nt，产量一般在1µmol以内，单个循环耗时6~8min。权衡效率与成本后最长合成长度通常控制在100nt左右。若将合成柱固定到多孔装载板上，单轮合成通量可提高到1536根，平均偶联效率为99.5％，错误率约1.53/717nt，成本大约0.277美分/碱基。

柱式DNA合成技术发展至今，自动化合成设备成熟。能够方便、灵活地提取用于合成某段基因所需的任意寡核苷酸片段，满足一般实验的要求。随着合成生物学领域对大规模基因和基因组合成需求的日益高涨，柱式合成持续合成能力弱、化学试剂耗费大、副反应多、通量低等不足也日益凸显。为突破低效率、低通量、高成本的限制，寻求DNA合成技术持续发展的研究主要致力于：

①  开发具备高反应通量、多重功能的集成芯片作为固相载体，并行合成寡核苷酸；

②  开发基于无模板单链DNA合成的酶促寡核苷酸合成技术。

芯片可作为DNA合成固相载体，以高密度、集成方式在其表面特定位点上进行合成反应，从而在节省试剂的同时实现高通量合成。芯片DNA合成技术仍以亚磷酰胺合成法四步反应循环为基础，但采用不同的“脱保护”定点控制方法，分别发展出了光刻合成、电化学合成和喷墨打印合成等DNA合成平台。

最早出现的光刻合成通过精确控制光在芯片表面指定位点的投射，分解光敏保护基团或光敏催化剂产酸进行脱保护，实现核苷酸在不同合成位点的有序添加。根据光照控制方式又分为掩模光刻合成（为Affymetrix采用）与无掩模光刻合成（为NimbleGen和LCSciences采用）。电化学合成利用电化学反应产生酸，控制聚合物膜上常规亚磷酰胺单体的加成，被CustomArray（已被Genscript收购）所采用。Agilent的喷墨打印合成则通过将酸溶液或试剂喷射在反应位点催化脱保护。

芯片DNA合成的通量高，通过精密的自动化控制，芯片上单个微反应室能以皮升级的反应体系进行合成反应。不同芯片合成通量在3×103～3×106之间，合成密度在105～106/cm2，成本低至0.001~0.1美分/碱基。与柱式合成相比，在进行大规模基因合成时，芯片合成法占有绝对优势。但芯片制作工艺复杂，随着合成密度的增加，对芯片生产技术以及合成仪的自动化控制技术要求也高。此外，芯片合成还存在由定点错位或试剂隔离不良而产生“边缘效应”、脱保护反应不彻底、脱嘌呤等副反应多的问题。这些因素直接影响合成序列的完整性和正确性，使DNA芯片合成的效率在90%~99%，合成长度限制在25~200nt。芯片单个微量反应体系合成的寡核苷酸产量低（约为10-15mol），错误率也高于柱式合成，难以单独分离纯化。因此，不适用于单基因或小规模的基因、常规探针以及引物合成。

DNA化学合成中大量使用有毒、易燃且不稳定的有机试剂，环境友好度低，因而生物合成又重新受到人们的关注。常规的DNA聚合酶具有模板依赖性，无法用于DNA的从头合成。寻找非模板依赖性的DNA合成酶成为酶法DNA合成技术开发的首要任务。此外，使酶在受控条件下逐个添加指定的核苷酸是酶促寡核苷酸合成技术的另一挑战。

Mackey和Gilham使用核苷酸磷酸化酶（PNPase）将引入2'末端封闭的5'-二磷酸-2'-O（-α-甲氧基乙基）核苷酸偶联到寡腺苷酸引物的3'末端，定序合成了寡聚核糖核苷酸链。Gillam和Smith采用相同的方法合成了寡聚脱氧核糖核苷酸链。England和Uhlenbeck则是首先将连接法用于DNA合成，使用T4RNA连接酶将5'，3'-核糖核苷二磷酸底物偶联到引发链的3'末端合成寡核糖核苷酸链。1999年，T4RNA连接酶首次被用于固相酶法DNA合成。尽管PNPase和T4RNA连接酶能够合成RNA和DNA，但两者偶联效率低，单轮循环耗时长，用于DNA合成技术的局限性大于可用性。

Bollum首先发现末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），并于1962年提出TdT可用于单链寡核苷酸合成。1984年，Schott和Schrade用TdT将dNTPs添加到不同长度的引发链。研究发现TdT对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链DNA可产生长达8000nt的均聚物。TdT用于可控酶促DNA合成还需有效的可逆终止方法。使用带有阻断基团的RTdNTP（RT为可逆终止子，可在dNTP的3'-OH或其他位置）为底物，通过偶联-去阻断两步循环迭代，有望将TdT用于长链寡核苷酸的定序合成。具有开发潜力的阻断基团包括氨基、烯丙基、磷酸基团、2-硝基苄基、3'-O（-2-氰乙基）等。2018年，Keasling团队另辟蹊径在单分子TdT上用可裂解接头连接单个核苷酸，利用TdT将核苷酸添加到引物链后仍保持与DNA链的连接，有效地阻止DNA链的进一步延伸。

裂解接头释放TdT后，DNA即可重新进行新一轮的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7%，单个循环仅需2~3min。最近，DNAscript公司通过TdT改造结合阻断基团宣称通过酶法以高达99.5%的偶联效率合成了长达280nt的寡核苷酸。而CamenaBioscience所宣传的酶法DNA合成技术gSynth的偶联效率更高达99.9%。同时，gSynth在合成300nt寡核苷酸片段时，产物中全长序列比例达到了85.3%，远高于亚磷酰胺合成法的22.7%。虽然酶法DNA合成技术至今还未见商业化，但从其所具有的潜力可以预见酶法DNA合成技术将引领新一轮的DNA合成技术革命。

酶作为酶促DNA合成的关键分子机器，控制聚合物的形成。因此，酶促合成技术的特征与酶功能紧密相关。酶的聚合方式和反应条件温和的特点，使基于酶促的偶联-去阻断两步法循环更为简单，并能有效减少合成过程中发生的DNA损伤和副反应，有持续合成更长的寡核苷酸片段的潜力。现在DNA酶促合成技术处于快速发展期，合成过程还存在诸多亟待解决的问题。包括天然酶对修饰RT-dNTP的掺入效率低、阻断基团的去除、合成无法从头起始或需要一定长度的引发链（如TdT，>3nt）等。这些问题的核心在于对酶分子机器功能的设计改造和控制策略的开发。通过挖掘新酶、改造酶、研制人工酶等方法提升DNA合成酶的功能，以高效掺入RT-dNTP；开发新的可控策略适应酶促合成自动化，如通过精细控制辅因子来控制酶活，以提高可控合成效率和长度，也将有助于推动酶促DNA合成的应用。