原核蛋白表达FAQ
原核蛋白表达FAQ
1. 原核蛋白表达实验流程是什么？
步骤名称 | 主要操作 |
确定基因序列 | 根据实验需求，在NCBI上找到目的基因序列。 |
选择表达载体 | 选择合适的载体，常见原核表达载体是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等。 |
选择表达宿主 | BL21（DE3）、Rosetta系列菌株 |
原核表达质粒的构建 | 在MCS上选择合适的酶切位点，载体与目的基因用同样的双酶切后，进行胶回收、连接、转化、测序验证。 |
质粒的克隆与鉴定 | 首先将质粒分别转化进入DH5α感受态、BL21感受态，然后挑取单克隆菌落，送菌液核酸测序，测序后，使用Snapgene软件比对测序结果。比对结果见附录。及时小提质粒，进行质粒的入库和保存，同时保菌。 |
重组蛋白的表达和纯化 | 转化后，按照菌液百分之一的比例接菌，千分之一的比例加入卡那霉素，37℃220 r/min，6小时后，测定吸光度OD600 nm值，在0.6～0.8范围内为最佳。 |
| 当菌落生长状态达到对数生长期后，根据预实验确定IPTG的合适浓度梯度，加入IPTG，使其终浓度为1.0 mmol/L。37℃ 220 r/min培养6 h后，8000 r/min离心3 min，收集菌体沉淀，并用PBS将沉淀清洗三次。 |
菌体裂解 | 接着，菌体沉淀需要经过超声破碎，室温裂解。1 L菌液沉淀用20 mL PBS重悬，破碎菌体，10 W功率下超声1 h后，12000 rpm离心15 min收菌。去上清，将沉淀用lysis buffer重悬，室温裂解2 h。裂解完毕后，12000 rpm离心15 min，留上清，得蛋白裂解液，用0.45 μm滤器过滤。 |
聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 蛋白表达后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白的表达情况。对比诱导前、诱导后目的条带的表达情况，确认是否成功表达。 |
目的蛋白的纯化 （根据标签的不同，选择对应的纯化方法即可。） | 此时的蛋白裂解液中包含所有蛋白，为了纯化目的蛋白，利用镍离子与His标签结合的特性，选择了Ni-NTA预装重力柱。纯化具体流程描述如下：流出预装液，用二馏水清洗柱子，加入10 mL Binding buffer（5 mM 咪唑的8 M Urea PBS）平衡柱子，调整转速25 r/min，挂蛋白，该操作重复三次；接着用Binding buffer洗杂，洗至溶液Protein A280接近基线时，换用Elution buffer（500 mM 咪唑的8 M Urea PBS）洗脱目的蛋白，保留并记录样品浓度，洗至溶液Protein A280接近基线后，处理柱子，再用5倍柱体积的Binding buffer洗至溶液浓度到达基线，再用二馏水清洗，最后保存于20%乙醇中。注：全程操作柱子不可以流干，否则损坏柱料，影响纯化效果。 |
测定蛋白浓度，验证 |
答：我们可以从网络上的一些数据库来了解蛋白分子量大小、有无信号肽、跨膜结构域、亲疏水性等，预测蛋白的二级结构、三级结构，参考文献调研总结蛋白表达注意事项，分析是否进行融合蛋白表达、是否添加标签等、进行密码子优化。
3. 蛋白表达量低怎么办？
答：在进行大量诱导表达前，最好进行预实验。主要因素包括：诱导剂IPTG的浓度、诱导时间、诱导温度，通过单因素变化的预实验，得出蛋白表达量最高的条件。
4. 可溶性表达不出来怎么办？
答：为了促进蛋白的可溶性表达，可以尝试在目的蛋白的N端或C端添加融合标签，常见的有GST、SUMO标签。但需要根据蛋白的下游应用，判断是否需要进行标签的去除。
5. 出现包涵体表达怎么办？
答：如果蛋白的实际应用不需要有活性，包涵体表达也没关系。但是后续蛋白的纯化过程需要在变性条件下进行。
6. 序列带有亲和标签，但为什么不挂柱？我们该如何处理？
答：常见原因有两种。一是标签短，目标肽链相对较大，标签因被包裹而未暴露，我们可以通过给标签和目的片段中间加个linker的方式来进行改善；二是结构不正确，发生了高度聚集，标签未暴露，第一我们可以改变构建策略，第二是优化缓冲液，让标签充分暴露出来。
7. 蛋白在纯化过程中发生降解该如何改善？
答：我们需要根据降解出现的时间进行对应处理。如果发生在培养过程中，我们需要优化培养条件，可能是营养物质过于丰富等原因，可以通过优化培养基、培养的温度来改善；如果我们排除了是培养过程中发生的降解，那么可能是纯化过程发生了降解，解决办法是加蛋白酶抑制剂、低温处理环境，降低物理剪切力。
8. 原核表达常用载体？
答：pET系列载体的使用在原核中是最常见的，诱导剂为乳糖或IPTG，也属于常见诱导剂类型。pET系列载体的优点是标签形式多样，便于纯化；缺点是高表达，会容易形成包涵体。pGEX-4T-1载体是一种常用的原核表达载体，该载体全序列中含有tac启动子、GST标签序列，可在BL21、Rosstea等表达菌株中高表达融合有GST标签的蛋白，且用凝血酶可将目的蛋白的GST标签切掉，便于下游蛋白纯化。
