可溶性蛋白与包涵体蛋白纯化策略
可溶性蛋白与包涵体蛋白纯化策略
蛋白纯化是利用蛋白间的相似性与差异性来进行的。利用蛋白间的相似性来去除非蛋白物质；利用蛋白的差异性将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。关于可溶性蛋白与包涵体蛋白一般是原核表达中涉及的概念。可溶性蛋白指可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白。包涵体是外源基因在原核细胞中表达时（尤其在大肠杆菌中高效表达时），形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。包涵体通常在细胞质中形成；如果使用分泌载体，它们可以在周质空间形成。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可溶性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。包涵体形成与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成与宿主菌的培养条件有关，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素。
1. 原核表达重组蛋白提取
根据蛋白表达方式来收集培养基上清（分泌表达）或者是菌体（胞内或周质空间表达），培养基上清表达的情况较少，收集到的菌体使用一定的缓冲液重新悬浮起来，悬浮起来后进行破碎处理，破碎方式有超声破碎、高压均质，如果是周质空间表达的话，可以通过渗透压、反复冻融的方式让蛋白充分释放；处理完成后需要进行离心，离心后分离上清液和沉淀（包涵体）。
其中，收集的培养基上清（分泌表达）和离心后分离的上清均为可溶性蛋白；离心后得到的沉淀为包涵体蛋白。
2. 可溶性蛋白纯化策略-CIPP纯化策略
首先明确需求，根据需求选择合适的纯化策略。
层析纯化领域最为经典就是由Cytiva提出的CIPP（Capture, Intermediate Purification, Polishing）纯化策略。该理论认为生物大分子的纯化需要在分辨率（Resolution）、速度（Speed）、载量（Capacity）和回收率（Recovery）之间取得平衡。
主要步骤为：
Capture（捕获）：分离、浓缩和稳定目标产物，去除主要杂质；
Intermediate Purification（中间纯化）：将大量杂质去除；
Polishing（精纯）：最困难的纯化步骤，去除难以去除的杂质，得到高纯度产物。
CIPP纯化策略中各层析技术使用频率
纯化方法 | Caption | Purification | Polishing | 特点 |
亲和层析（AC） | ▲▲▲ | ▲▲▲ | ▲ | 特异性好，但是很难去除同样敏感的杂质 |
离子层析（IEX） | ▲▲ | ▲▲▲ | ▲▲▲ | 对起始电导有要求 |
疏水层析（HIC） | ▲ | ▲▲ | ▲ | 高盐上样、受温度影响较大、收率偏低 |
反向层析（RPC） |
| ▲ | ▲▲▲ | 使用方式pH极端或有机溶剂，导致蛋白失活 |
分子筛（SEC） |
| ▲ | ▲▲▲ | 上样体积受限、流速受限、时间长、寿命短 |
3. 包涵体蛋白纯化策略
包涵体样品变复性处理：前期预处理、包涵体溶解、复性。
前期预处理：
菌体破碎（超声破碎、高压均质）
包涵体洗涤，去掉一定的脂质、膜蛋白、杂蛋白
缓冲体系：PB、PBS、Tris
去污剂：Tween20、Trition X-100
添加剂：尿素、EDTA、盐酸胍
包涵体溶解：
Buffer：PB、PBS、Tris
溶解试剂：8M 尿素、6M 盐酸胍、7M 盐酸胍
还原剂：DTT、β-ME、TCEP
洗涤剂：SDS、CHAPS、N-lauroylsarcosine
极端pH：低、高
纯化变性蛋白方式：亲和纯化、离子纯化、分子筛纯化、反向纯化
包涵体复性：
复性缓冲液：参考文献、广谱筛选
复性方法：稀释（透析属于稀释）、柱上复性
复性条件：浓度、温度、搅拌速率、时间、换液（及换液方式）
